LAPORAN PENELITIAN MIKROBA pada NASI BASI
(Rhizopus Olingosporus)
OLEH :
Kls/Smt : A/II
Nama Kelompok :
- Putu Ayu Purnamasari (131010)
- Komang Ayu Sarini (131011)
- Dewi Putriyani (131012)
- Ni Luh Dian Pratiwi (131013)
- I Putu Esa Diputra Anjasmara (131014)
- Dewa Ayu Dwina Inggriani (131015)
- Dewa Ayu Embas Saraswati (131016)
- Ni Putu Erna Widiasmini (131017)
- Eugenius Surya Puji (131018)
AKADEMI FARMASI SARASWATI DENPASAR
2014
1.1 Landasan Teori
A. Sterilisasi
Yang dimaksud sterilisasi dalam mikrobiologi adalah suatu proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat pada atau didalam suatu benda. Ketika anda untuk pertama kalinya melakukan pemindahan biakan bakteri secara aseptik, sesungguhnya anda telah menggunakan salah satu sterilisasi, yaitu pembakaran. Namun kebanyakan peralatan dan media yang umum dipakai dalam pekerjaan mikrobiologis akan menjadi rusak bila dibakar. Untungnya tersedia berbagai metode lain yang efektif (Hadioetomo, 1993).Salah satu cara sterilisasai adalah sterilisasi dengan menggunakan tekanan atau sterilisasi uap (autoclaf) Pada saat melakukan sterilisasi uap, kita sebenarnya memaparkan uap jenuh pada tekanan tertentu selama waktu dan suhu tertentu pada suatu objek, sehingga terjadi pelepasan energi laten uap yang mengakibatkan pembunuhan mikroorganisme serta ireversibel akibat denaturasi atau koagulasi protein sel (Lukas, 2006).
Sterilisasi demikian merupakan metode yang paling efektif dan ideal karena:a. Uap merupakan pembawa (carrier) energi termal paling efektif dan semua lapisan pelindung luar mikroorganisme dapat dilunakkan, sehingga memunginkan terjadinya koagulasi.b. Bersifat nontoksik, mudah diperoleh, dan relative mudah dikontrol. Suhu jenuh uap air (100oC) pada tekanan 1 atmosfir ternyata masih kurang dalam membunuh kuman yang resisten. Oleh karena itu, kita harus mengupayakan agar suhu jenuh uap ditingkatkan dengan cara meningkatkan tekanananya. Kemudian, kita dapat melakukannya dalam wadah tertutup rapat agar dapat tercapai suhu sterilisasi, yaitu 121oC atau lebih (Lukas, 2006). Sterilisasi demikian biasa digunakan untuk mensterilkan:Sediaan injeksi dan suspensi : 121oC 15 menitBaju operasi : 134oC 3 menitPlastik dan karet : disterilkan terpisah dari containerSiklus sterilisasi uap meliputi pada fase pemanasan (conditioning), pemaparan uap(exposure), pembuangan (exhaust), dan pengeringan (Lukas, 2006). Faktor-faktor yang mempengaruhi sterlisasi uap adalah:a. Waktub. Suhuc. Kelembaban
B. Pembuatan Media
Medium adalah tempat untuk menumbuhkan mikroba. Mikroba memerlukan nutrisi untuk memenuhi kebutuhan energi, bahan pembangun sel, dan sintesis protplasma serta bagian-bagian sel lainnya. Setiap mikroba mempunyai sifat fisiologis tertentu, sehingga memerlukan nutrisi tertentu pula. Susunan kimia sel mikroba relative tetap, baik unsur kimia maupun senyawa yang terkandung di dalam sel. Penyusun utama sel adalah C, H, O, N, dan P, yamg jumlahnya sekitar 95% dari berat kering sel, sedangkan sisanya tersusun dari unsur-unsur lain yaitu air 80-90% dan bagian-bagian lain 10-20% terdiri dari protoplasma, dinding sel, lipida untuk cadangan makanan, polisakarida, polifosfat, dan senyawa lain. Ada tiga jenis media pengembangbiakan berdasarkan konsentrasinya antara lain:a) Media padat, yaitu media berbentuk padat yang mengandung agar 1-1,5% misalnya nutrient agar
b) Media cair yaitu media yang berbentuk cair yang tidak mengandung agar, misalnya nutrient broth
c) Media semi padat, yaitu media yang berbentuk padat pada suhu dingin, dan berbentuk cair bila suhu panas, misalnya media SIM (media yang digunakan untuk uji produksi sulfur, indiol, motilitas.
Fungsi-fungsi medium adalah sebagai berikut :· Media basal dapat mendukung pertumbuhan berbagai jenis spesies tanpa syarat nutrisi
· Media penghambat merupakan medium yang memuat unsur pokok tertentu yang menghambat pertumbuhan dari jenis mikroorganisme tertentu.
· Medium pemeliharaan digunakan untuk pertumbuhan awal dan penyimpanan selanjutnya, mempersiapkan kultur organisme yang disimpan baik pada suhu ruang atau suhu dingin (Singleton, dkk, 2001)
C. Pengambilan Sampel
Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution)· Teknik Preparasi SuspensiSampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam preparasi bergantung kepada bentuk sampel.a. Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut. Contohnya adalah meja, batu, batang kayu dll. Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan permukaan sampel. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan atraktan semisal pepton water.
- Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun bunga dll. Rinse merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v). Contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan akuades 45 ml yang terdapat dalam beaker glass.
- Maseration (pengancuran), sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air. Contoh sampelnya antara lain bakso, biji, buah dll. Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v). Untuk sampel dari tanah tak perlu dimaserasi.
- Teknik Pengenceran Bertingkat
Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya.
- Penanaman
Penanaman bakteri atau biasa disebut juga inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Untuk melakukan penanaman bakteri (inokulasi) terlebih dahulu diusakan agar semua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium agar tetap steril, hal ini agar menghindari terjadinya kontaminasi.
Teknik penanaman antara lain :
- Teknik penanaman dari suspensi
Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir.
a.1. Spread Plate (agar tabur ulas)
Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni. Setetes inokolum diletakan dalam sebuah medium agar nutrien dalam cawan petridish dan dengan menggunakan batang kaca yang bengkok dan steril. Inokulasi itu disebarkan dalam medium batang yang sama dapat digunakan dapat menginokulasikan pinggan kedua untuk dapat menjamin penyebaran bakteri yang merata dengan baik .Pada beberapa pinggan akan muncul koloni koloni yang terpisah –pisah.
a.2. Pour Plate (agar tuang)
Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen.
- Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)
Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru. Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan ketrampilan-ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah Inokulum digoreskan di permukan media agar nutrien dalam cawaan petridish dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi koloni.
b.1 Goresan Sinambung
Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.
b.2 Goresan T
b.3 Goresan Kuadran (Streak quadrant)
- Pengamatan Pertumbuhan
Ada beberapa cara untuk mengukur atau menghitung microbial yaitu dengan perhitungan jumlah sel, perhitungan massa sel secara langsung, dan pendugaan massa sel secara tak langsung. Perhitungan jumlah sel dapat dilakukan dengan 3 metode yaitu dengan hitungan mikroskopik, MPN (Most Probable Number), dan hitungan cawan (Fardiaz, 1989). Dari ketiga metode tersebut, metode hitungan cawan paling banyak dan mudah digunakan. Oleh karena itu, pada kegiatan praktikum mikrobiologi untuk perhitungan koloni sampel, digunakan metode hitungan cawan. Prinsip dari metode hitungan cawan adalah menumbuhkan sel mikrobia yang masih hidup pada metode agar, sehingga sel mikrobia tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpamenggunakan mikroskop (Fardiaz, 1993).
Metode hitungan cawan dapatdibedakan atas dua cara yaitu:
- Metode tuang (pour plate)
2. Metode permukaan (surface / spread plate).
Pada perhitungan menggunakan metode cawan, diperlukan suatu pengenceranagar jumlah koloni mikrobia yang ada pada cawan dapat dihitung dan sesuaistandar, yaitu berjumlah
30 – 300 per cawan. Pengenceran dilakukan secaradesimal untuk memudahkan perhitungan.
- Pewarnaan
Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan pembesaran 100 x 10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan.
Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negative. Zat warna basa lebih banyak digunakam kerena matan negative banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin,Congo Red dll.
Adapun macam-macam pewarnaan, antara lain :
- Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan dengan menggunakan satu jenis pewarna saja dengan tujuan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya. Pewarnaan ini dapat menggunakan pewarna basa pada umumnya, antara lain : kristal violet, metylen blue, karbol fuchsin, dan safranin.
- Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokkan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Pewarna yang digunakan antara lain : kristal violet sebagai gram A, iodine sebagai gram B, alkohol sebagai gram C, serta safranin sebagai gram D.
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokkan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Pewarna yang digunakan antara lain : kristal violet sebagai gram A, iodine sebagai gram B, alkohol sebagai gram C, serta safranin sebagai gram D.
- Pewarnaan Kapsul
Pewarnaan ini mengunakan dua reagen, yaitu: kristal violet sebagai dekolorisator (penghapus warna utama) serta kopper sulfat sebagai pewarna tandingan teradsorbsi bahan kapsular yang mengalami dekolorisasi. Hasil pewarnaannya ialah kapsul akan berwarna biru terang kontras dengan warna ungu gelap dari sel.
Pewarnaan ini mengunakan dua reagen, yaitu: kristal violet sebagai dekolorisator (penghapus warna utama) serta kopper sulfat sebagai pewarna tandingan teradsorbsi bahan kapsular yang mengalami dekolorisasi. Hasil pewarnaannya ialah kapsul akan berwarna biru terang kontras dengan warna ungu gelap dari sel.
- Pewarnaan Spora
Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malchit green dan safranin, yang dalam hasil pewarnaanya akan muncul warna hijau pada sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya, yaitu pada Bacillus subtilis.
Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malchit green dan safranin, yang dalam hasil pewarnaanya akan muncul warna hijau pada sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya, yaitu pada Bacillus subtilis.
Teknik- teknik pewarnaan secara umum, antara lain :
- Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan ini digunakan untuk visualisasi bentuk morfologis yang berupa basil, kokus, basil, vibrio dan spiral), dan susunan (rantai, gerombol, berpasangan, dan tetrad).
- Pewarnaan diferensial
Pewarnaan ini digunakan untuk pemisahan dalam kelompok yang terbagi menjadi dua, yaitu pewarna gram dan pewarna tahan asam. Selain itu juga digunakan untuk visualisasi struktur yang dibedakan menjadi empat, yaitu pewarna kapsul, pewarna flagel, pewarna spora, dan pewarna inti.
Pewarnaan ini digunakan untuk pemisahan dalam kelompok yang terbagi menjadi dua, yaitu pewarna gram dan pewarna tahan asam. Selain itu juga digunakan untuk visualisasi struktur yang dibedakan menjadi empat, yaitu pewarna kapsul, pewarna flagel, pewarna spora, dan pewarna inti.
dalam praktikum kali ini menggunakan pewarnaan gram dengan sampel tanah, karena dalam waktu 24 jam sampel daun yang di simpan pada inkubator, bakteri yang terdapat pada daun tidak tumbuh pada media NA
Pewarnaan gram masih merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan untuk mencirikan banyak bakteri. Terutama amat berarti di laboratorium diagnostik rumah sakit karena informasi yang diperoleh dari pengamatan spesimen yang diwarnai dengan pewarnaan gram dengan cepat dapat memberi petunjuk akan organisme penyebab suatu infeksi . Bakteri gram negatif berbeda dari bakteri gram positif yaitu bakteri gram negatif lebih rentan terhadap asam antibiotik seperti streptomisin. Bakteri gram positif pada umumnya lebih rentan terhadap antibiotik penisilin dan kurang rentan terhadap disintegrasi oleh perlakuan mekanis atau bila diberi enzim-enzim tertentu .Faktor-faktor yang mempengaruhi dalam pewarnaan mikroba antara lain adalah fiksasi, peluntur warna, subtrat, intensifikasi pewarna untuk mempercepat pewarnaan mikroba sehingga zat akan terikat lebih mudah di dalam jaringan. Zat warna penutup untuk memberikan warna kontras pada sel mikroba, yang diwarnai yang tidak menyerap warna pula.
METODE
- Waktu dan Tempat Praktikum Mikrobiologi
| No | Hari | Tanggal | Tempat | Keterangan |
| 1 | Sabtu | 14 Juni 2014 | Laboratorium AFS | Sterilisasi Alat |
| 2 | Senin | 16 Juni 2014 | Lantai 3 Gedung AFS | Pembuatan Media, Pengambilan sampel dan Penanaman sampel |
| 3 | Rabu | 18 Juni 2014 | Lantai 3 Gedung AFS | Pengamatan Mikroba dan Pewwarnaan Mikroba |
- Alat dan Bahan yang Digunakan
- Alat yang digunakan :
- Sterilisasi
- Autoclaf 1 Buah
- Cawan Petri 3 Buah
- Beaker Glass 1 Buah
- Batang Pengaduk 1 Buah
- Tabung Reaksi 5 Buah
- Pipet Volume 8 Buah
- Batang L 1 Buah
- Moartar dan Pestle 1 Buah
- Kertas Secukupnya
- Tali Secukupnya
- Pembuatan Media
- Autoklaf 1 Buah
- Cawan Petri 3 Buah
- Hot Plate Stirer 1 Buah
- Beaker Glass 1 Buah
- Pengambilan Sampel
- Tabung reaksi 5 Buah
- Pipet volume 5 Buah
- Pipet filler 1 Buah
- Timbangan analitik 1 Buah
- Beaker glass 1 Buah
- Mortar dan Pestle 1 Buah
- Batang Pengaduk 1 Buah
- Penanaman
- Pipet volume 3 Buah
- Cawan petri 3 Buah
- Batang L 1 Buah
- Lampu Bunsen 1 Buah
- Inkubator 1 Buah
- Laminar Air Flow 1 Buah
- Kapas/Tissue Secukupnya
- Pipet filler 1 Buah
- Pengamatan Pertumbuhan
- Coloni counter 1 Buah
- Pulpen 1 Buah
- Pewarnaan
- Kaca object 1 Buah
- Lampu Bunsen 1 Buah
- Penjepit Tabung Reaksi 1 Buah
- Jarum Inokulum (ose) 1 Buah
- Mikroskop 1 Buah
- Kapas/Tissue Secukupnya
- Bahan yang digunakan :
- Sterilisasi
- Air
- Pembuatan Media
- PDA (Potato Dextrosa Agar)
- Aquadest
- Pengambilan Sampel
- Nasi Basi
- Penanaman
- Tabung Reaksi yang berisi Mikroba
- Media Agar
- Pengamatan Pertumbuhan
- Sampel nasi basi yang berisi bakteri
- Pewarnaan
- Sampel hasil penanaman
- Aquadest
- Kristal violet
- Mordant (lugol iodine)
- Ethanol 96%
- Safranin
- Cara Kerja
- Sterilisasi
- Siapkan alat-alat yang akan disterilisasi
- Bungkus alat-alat tersebut dengan menggunakan kertas Koran atau allumunium foil dan ikat menggunakan tali
- Setelah semuanya selesai, beri air di dalam autoclave hingga menutupi elemen autoklaf, kemudian masukan alat kedalam keranjang autoclave
- Nyalakan autoclave sampai suhunya mencapai 121°C
- Setelah suhunya 121°C, tunggu selam 5 menit lalu buka katup uap autoclave, sampai suhunya turun menjadi 0oC
- Kemudian buka katup uap autoclave dengan perlahan, dan ambillah alat yang sudah disterilisasi menggunakan lap
- Pembuatan Media
- Siapkan alat dan bahan yang diperlukan
- Nyalakan hot plate stirrer
- Masukkan air kedalam beker glass
- Letakkan beker glass yang berisi air didalam hot plate
- Masukkan agar kedalam beaker glass yang berisi air
- Tunggu sampai air dan agar homogen
- Siapkan cawan petri dan tabung reaksi yang sudah disterilisasi
- Tuang agar yang sudah homogen kedalam cawan petri dan tabung reaksi yang sudah disterilisasi
- Pengambilan Sampel
- Siapkan alat yang sudah disterilkan.
- Nasi yang berbentuk padat ditumbuk dengan mortar dan pestle
- Timbang nasi basi di timbangan analitik
- Buatlah perbandingan nasi dan air 1 : 9 (w/v) di dalam beaker glass
- Sampel yang mengandung bakteri dimasukkan ke dalam tabung pengenceran pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9. Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocokannya
- Diambil 1 ml dari tabung 10-1dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung 10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen.
- Pemindahan dilanjutkan hinggatabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama. Sampai pengenceran ke 3
- Tutup dengan kapas ujung tabung reaksi.
- Penanaman
- Ambil agar yang sudah disterilkan dan letakkan di safety cabinet.
- Ambil tabung reaksi yang sudah berisi sampel .
- Tuang 0,1 ml ke dalam cawan petri yang sudah berisi agar.
- Ratakan dengan batang L yang sudah steril (di pijar) .
- Tutup cawan petri yang sudah berisi biakan dan pindahkan ke dalam inkubator.
- Tutup inkubator. Tunggu selama 24 jam .
- Pengamatan Pertumbuhan
- Setelah 24 jam sampel didiamkan dalam inkubator, kita lihat apakah bakteri berkembang biak atau tidak
- Jika berkembang biak, amati warna koloni bakteri
- Amati pula jumlah koloni bakteri yang terbentuk di coloni counter
- Pewarnaan
- Siapkan alat dan bahan yang akan dilakukan pewarnaan.
- Ambil biakan yang sudah ditumbuhi mikroorganisme.
- Ambil sedikit biakan,diletakkan di kaca preparat dengan menggunakan jarum inokulum yang telah dipijar.
- Kemudian kaca object yang telah berisi mikroba dipanaskan di atas lampu bunsen, hingga mikroba menempel pada permukaan kaca object
- Teteskan Kristal violet secara merata sampai menutupi permukaan mikroba dan tunggu ± 1 menit
- Cuci dengan aquadest mengalir
- Teteskan mordant (lugol’s iodine) lalu tunggu ± 1 menit
- Cuci dengan aquadest mengalir
- Berilah larutan pemucat (etanol 96% / aseton ) setetes demi setetes hingga ethanol yang jatuh berwarna jernih. Jangan sampai terlalu banyak, tunggu ± 1 menit
- Cuci dengan aquadest mengalir
- Teteskan safranin dan tunggu selama ± 45 detik.
- Keringkan preparat dengan kertas tissue, yang ditempelkan di sisi ulasan biarkan mengering di udara
- Letakkan kaca preparat dalam mikroskop.
- Amati warna mikroorganismenya.
HASIL PRAKTIKUM
- Sterilisasi
Menggunakan autoclaf
- Pembuatan Media
Pada praktikum ini kami menggunakan PDA
- Pengambilan sampel
Pengambilan sampel yang kami gunakan adalah maserasi dan pengenceran 10-5
- Penanaman Media
- Pengamatan Pertumbuhan
- Pewarnaan
- Jamur yang terdapat pada nasi
PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini kelompok kami mengamati bakteri koloni pada sampel nasi basi. Terlebih dahulu kami melakukan sterilisasi alat yang akan digunakan pada praktikum. Sterilisasi yang digunakan yaitu sterilisasi basah. Sterilisasi basah merupakan sterilisasi yang menggunakan suhu tinggi dengan dibantu uap air. Sterilisasi ini menggunakan autoklaf. Dengan autoklaf ini, tekanan dan temperature diatur dengan jumlah panas dari api. Dalam sterilisasi ini, yang dilakukan adalah sebagai berikut, hal pertama yang dilakukan adalah memeriksa banyaknya air dalam autoklaf, lalu memasukkan alat/bahan yang akan disterilkan lalu tutup dan kencangkan skrup pengaman, setelah itu menyalakan api dan membiarkannya katup uap terbuka sampai semua udara dalama utoklaf diganti dengan uap. Kemudian menutup katupnya. Proses sterilisasi dimulai setelah suhu meningkat hingga 1210C dan tekanan 1 atm atau 15 lbs selama 15-20 menit. Setelah selesai, kemudian mematikan api, dan biarkan tekanan turun sampai 0. Dan yang terakhir yaitu membuka tutup autoklaf, lalu ambil alat yang telah disterilisasi. Media yang digunakan yaitu PDA (Potato Dextrosa Agar). Tujuan digunakannya media ini yaitu karena di dalam nasi tidak hanya terdapat bakteri tetapi juga terdapat fungi atau jamur. Medium PDA berfungsi untuk menumbuhkan dan mengembangbiakan fungi atau jamur serta medium PDA mengandung nutrisi – nutrisi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan jamur.
Pengambilan sampel dilakukan dengan cara maseration dan pengenceran bertingkat. Maseration (pengancuran) ini dilakukan dengan menumbuk sampel di dalam mortar menggunakan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan kedalam air. Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertamaa dalah 1 : 9 (w/v). Dalam praktikum ini dilakukan pengenceran sebanyak 5 kali. Pengenceran yang digunakan untuk penanaman yaitu pengenceran yang ketiga, keempat dan kelima. Tujuan pengenceran ini agar mendapatkan bakteri yang lebih spesifik. Selanjutnya dilakukan penanaman sampel dengan mengambil agar yang sudah disterilkan dan letakkan di safety cabinet. Kemudian tabung reaksi yang sudah berisi sampel dituang sebanyak 0,1 ml ke dalam cawan petri yang sudah berisi agar, ratakan dengan batang L yang sudah steril (di pijar) proses tersebut dilakukan di dalam LAF (Laminar Air Flow). Tutup cawan petri yang sudah berisi biakan dan pindahkan ke dalam inkubator. Tutup inkubator. Tunggu selama 24 jam . Untuk pengamatan sampel yang kami gunakan adalah cawan petri dengan pengenceran ke 10-5, karena pengenceran yang ke 10-3 dan 10-4 terlalu banyak mengandung air. Dari pengamatan sampel dengan menggunakan coloni counter didapatkan 5 koloni setelah 2 hari. Warna dari koloni tersebut adalah putih, setelah pengamatan tersebut dilakukan pewarnaan gram pada bakteri untuk mengetahui tipe bakteri.
Pewarnaan gram ini dilakukan dengan cara membuat preparat ulas (smear) yang telah difiksasi dari bakteri gram positif missal bacillus subtilis dan gram negatif missal Escherichia coli, setelah membuat preparat ulas di teteskan Kristal violet sebagai pewarna utama pada kedua preparat, usahakan semua ulasan terwarnai dan tunggu selama ± 1 menit,lalu cuci dengan aquadest mengalir kemudian teteskan mordant(lugol,s iodine) tunggu ± 1 menit kemudian cuci dengan aquadest mengalir. Selanjutnya beri larutan pemucat (ethanol 96%/aseton ) setetes demi setetes hinga ethanol yang jatuh berwarna jernih jangan sampai terlalu banyak lalu cuci lagi dengan aquadest mengalir dan teteskan counterstain(safranin)dan tunggu sampai ± 45 detik kemudian cuci dengan aquadest mengalir yang terakhir preparat tadi dikeringkan dengan kertas tissue yang di tempelkan disisi ulasan dan jangan sampai merusak ulasan.
Hasil pewarnaan tersebut yaitu bakteri gram positif yang berbentuk basil, di dalam literatur disebutkan bakteri yang terdapat pada nasi basi adalah bacillus cereus. Karakteristik umum Bacillus cereus merupakan golongan bakteri Gram-positif (bakteri yang mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram), aerob fakultatif (dapat menggunakan oksigen tetapi dapat juga menghasilkan energi secara anaerobik), dan dapat membentuk spora (endospora). Spora Bacillus cereus lebih tahan pada panas kering daripada pada panas lembab dan dapat bertahan lama pada produk yang kering. Selnya berbentuk batang besar (bacillus) dan sporanya tidak membengkakkan sporangiumnya. Keracunan akan timbul jika seseorang menelan makanan atau minuman yang mengandung bakteri atau bentuk sporanya, kemudian bakteri bereproduksi dan menghasilkan toksin di dalam usus, atau seseorang mengkonsumsi pangan yang telah mengandung toksin tersebut. Ada dua tipe toksin yang dihasilkan oleh Bacillus cereus, yaitu toksin yang menyebabkan diare (disebabkan oleh protein dengan berat molekul besar) dan toksin yang menyebabkan muntah atau emesis (disebabkan oleh peptida tahan panas dengan berat molekul rendah). Gejala keracunannya, yaitu:Tipe penyebab diare (diarrheal form) atau Long IncubationTipe ini merupakan tipe yang paling ditemukan kasusnya dan terjadi bila seseorang mengalami keracunan yang disebabkan oleh toksin penyebab diare, maka gejala yang timbul berhubungan dengan saluran pencernaan bagian bawah berupa mual, nyeri perut seperti kram, diare berair, yang terjadi 8-16 jam setelah mengkonsumsi pangan yang telah terkontaminasi Bacillus cereus.
Jamur yang terdapat pada nasi basi adalah kapang dari filum Zygomicota yang banyak menghasilkan enzim protease. Zigomicota memiliki cirri-ciri miselium bercabang banyak dan hifa tak bersekat sehingga terlihat seperti pipa atau buluh. Tubuh tersusun dari stoln rizoid, dan sporangiofor. Tidak memiliki tubuh buah. Reproduksi aseksual dengan fragmentasi reproduksi seksual dengan zigospora. Sebagian saprofit makanan sisa/ tumbuhan sisa / hewan, sebagai parasit pada manusia dan tumbuhan, menguntungkan bagi lumut kerak.
KESIMPULAN
- Sterilisasi yang digunakan yaitu sterilisasi basah. Sterilisasi basah merupakan sterilisasi yang menggunakan suhu tinggi dengan dibantu uap air. Sterilisasi ini menggunakan autoklaf.
- Media yang digunakan yaitu PDA (Potato Dextrosa Agar). Tujuan digunakannya media ini yaitu karena di dalam nasi tidak hanya terdapat bakteri tetapi juga terdapat fungi atau jamur.
- Pengambilan sampel dilakukan dengan cara maseration dan pengenceran bertingkat. Maseration (pengancuran) ini dilakukan dengan menumbuk sampel di dalam mortar menggunakan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan kedalam air. Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertamaa dalah 1 : 9 (w/v). Dalam praktikum ini dilakukan pengenceran sebanyak 5 kali.
- Penanaman sampel dengan mengambil agar yang sudah disterilkan dan letakkan di safety cabinet. Kemudian tabung reaksi yang sudah berisi sampel dituang sebanyak 0,1 ml ke dalam cawan petri yang sudah berisi agar, ratakan dengan batang L yang sudah steril (di pijar) proses tersebut dilakukan di dalam LAF (Laminar Air Flow).
- Pengamatan sampel dengan menggunakan coloni counter didapatkan 5 koloni setelah 2 hari. Warna dari koloni tersebut adalah putih
- Hasil pewarnaan tersebut yaitu bakteri gram positif yang berbentuk basil, di dalam literatur disebutkan bakteri yang terdapat pada nasi basi adalah bacillus cereus.
- Jamur yang terdapat pada nasi basi adalah kapang dari filum Zygomicota
DAFTAR PUSTAKA
- Modul Praktikum Mikrobiologi Semester II
2. Bacillus Cereus.pdf
3. http://indonesiaindonesia.com/f/95357-bab-6-fungi-jamur/